克罗诺杆菌附属肠杆菌科，是一种食源性致病微生物。近年来，克罗诺杆菌被划分为7 个种和3 个亚种，此中阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌是临床的次要致病菌，可惹起婴长儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎等严沉疾病。婴儿配方奶粉（powdered innt formula，PIF）是其次要的污染路子之一，加工是主要的污染源。因而，世界粮食及农业组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）将克罗诺杆菌属列为PIF A类致病菌。因为克罗诺杆菌具有较强的顺应性，正在全球乳成品行业中的污染事务不竭发生。因而，火急需要对克罗诺杆菌的耐受性进行研究，阐发其耐受性机制，为PIF及食物行业的平安保障奠论根本。研究发觉克罗诺杆菌可存正在于各类干成品中，特别是PIF，且污染范畴普遍。克罗诺杆菌比大大都肠杆菌科其他菌种具有更强的抗干燥和抗渗入压能力，使其可以或许正在极低水分活度的PIF中持久存活。且奶粉培育基中的克罗诺杆菌比缓冲液中的克罗诺杆菌具有更高的耐干燥性，这可能是因为牛奶中的某些卵白质和乳糖能够包裹克罗诺杆菌菌株，从而正在干燥下细菌。研究表白，正在干燥前提下克罗诺杆菌可通过基因调控正在细胞内堆集钾离子、谷氨酸等电解质，添加细胞内渗入压，从而顺应细胞外干燥前提形成的高渗入。此外，克罗诺杆菌可能通过堆集海藻糖和甜菜碱等性多羟基化合物来加强其对干燥前提的抵当力。另一种理论认为，可以或许发生生物膜的克罗诺杆菌对干燥的抵当力更强。近年来，一些取干燥和渗入耐受性相关的基因已被确定，但其抵当干燥和渗入压的机制还没有获得充实的研究。因而，宁波大学付世骞，东北农业大学杨鑫焱副传授和姜毓君传授等以分手自PIF的35株克罗诺杆菌为研究对象，采用基质辅帮激光解吸电离飞翔时间质谱（matrixassisted laser desorption ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF MS）进行菌种判定，并对所有菌株进行了耐干燥性和耐渗入性评价，同时阐发了分手株的生物膜构成能力。进而别离拔取两种前提下最具代表性的菌株进行组测序，挖掘克罗诺杆菌正在干燥和高渗入压前提下的相关基因和调控路子。35 株分手株的MALDI-TOF MS判定成果取16S rRNA判定成果分歧，表白MALDI-TOF MS判定能无效区分克罗诺杆菌属。分手株所属的阪崎克罗诺杆菌（C。 sakazakii）、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌（C。 malonaticus）、苏黎世克罗诺杆菌（C。 turicensis）和都克罗诺杆菌（C。 dublinensis）四个尺度菌株的质谱如图1a所示。此中，C。 sakazakii和C。 malonaticus的质谱图离子峰最为接近，离子质荷比m/z正在2 690、4 364、5 380、6 255、7 275、9 475和10 284附近均呈现1 个离子峰，而C。 malonaticus又正在m/z 11 472和12 658附近各呈现1 个离子峰。MALDI-TOF MS成果的聚类阐发如图1b所示，正在参考了分手株所属4 个种的尺度菌株的根本上，克罗诺杆菌分手株被分为4 个大簇，属内分歧种的菌株可以或许被清晰地域分隔，各个种内分歧的分手株也可以或许进行无效的聚类和区分，申明MALDI-TOF MS分型的辨识度较高。菌株耐干燥环境如图2a所示，分歧克罗诺杆菌的耐干燥程度有所差别，受试分手株正在不异干燥前提下的失活率正在9。01%~77。57%。此中，干燥前提下具有较强耐受性的菌株为CS21（ST199）、CS19（ST83）、CS10（ST23）、CM3（ST7）和CS20（ST198），所对应的率别离为9。01%、15。11%、20。12%、23。81%和24。75%。最不耐干燥的菌株为CS5（ST12）、CS15（ST50）和CM16（ST60），率均跨越75%。经统计，干燥失活率低于50%的克罗诺杆菌共有14 株，正在50%~70%之间的克罗诺杆菌有16 株，此中参考菌株C。 sakazakii ATCC 29544T的率为60。24%，独一的1株C。 dublinensis分手株的失活率为67。75%，均处于中等耐干燥程度。别的，有6 株克罗诺杆菌的干燥失活率跨越70%。比拟之下，上述正在干燥前提下率较低的5 株克罗诺杆菌的耐干燥性更强。耐渗入压试验成果表白，受试分手株均可正在浓度为4%和6% NaCl的TSB液体培育基中发展，而且跟着盐浓度的添加，菌株达到对数期和不变期的时间耽误。因而，克罗诺杆菌可耐受的最高渗入压前提为6% NaCl，所有菌株正在此前提下的发展曲线c所示。比拟于参考菌株，部门C。 sakazakii分手株发展速度较快，且达到不变期的菌体浓度较高，此中发展速度最快的菌株为CS8、CS14和CS7，发展速度次之但不变期菌体浓度较高的菌株为CS10和CS81，发展最慢的菌株为CS11。大都菌株正在10~15 h达到对数期末期，仍有少数发展较慢的菌株正在24 h仍未达到不变期（如CS2和CS11）。非C。 sakazakii发展环境均不如尺度菌株。因而，耐渗入压能力较好的菌株为CS7（ST17）、CS8（ST21）、CS10（ST23）、CS14（ST42）和CS81（ST260），均为C。 sakazakii。生物膜构成能力成果如图3a所示，菌株CS17的生物膜构成能力最强，OD590 nm值为0。70；CS5的生物膜构成能力最弱，OD值仅为0。18。此中，有4 株菌株（CS20、CS10、CS21和CS14）的OD值处于0。5~0。7之间，生物膜构成能力仅次于CS17。有3 株菌株（CM24、CS32和CT23）的OD值处于0。3~0。5之间。大都菌株（25/36）的OD值分布正在0。2~0。3之间，此中参考菌株的OD值为0。25，处于中等程度。有3 株菌株的OD值小于0。20，表白其生物膜构成能力较弱。研究表白，克罗诺杆菌的生物膜构成能力取菌株的耐干燥性相关，因而，将菌株的耐干燥性和生物膜构成能力别离由强到弱陈列，获得两者相关性如图3b，大都耐干燥能力较强的菌株生物膜构成能力也较强，部门耐干燥能力较弱的菌株对应的生物膜构成能力也偏低。申明生物膜对细菌的包被布局对处正在干燥下的细胞具有感化。图3 (a) 克罗诺杆菌的生物膜构成能力；(b) 克罗诺杆菌耐干燥性取生物膜构成能力的相关性按照耐干燥和耐渗入试验成果，筛选CS21和CS8做为代表性菌株，别离正在干燥和高渗前提下进行组测序。选择富集最显著的前20 条通进行气泡图显示。正在干燥前提下（图4a），信号通可分为五大类，此中代谢类别数量最多，包含13 条信号通和150 个差别表达基因，次要集中正在碳水化合物代谢、脂质代谢、异种生物降解和代谢、能量代谢和氨基酸代谢过程。正在高渗前提下（图4b），信号通分为六大类，代谢类别也最多，包含9 条信号通和62 个差别表达基因，次要集中正在氨基酸代谢、萜类和多酮类代谢、次生代谢物的生物合成、辅因子和维生素代谢、碳水化合物的合成和代谢、核苷酸代谢过程。按照干燥处置下RNA-seq阐发成果，共筛选到56 个取耐干燥相关的基因，此中31 个基因差别表达。按照渗入压力处置下RNA-seq阐发成果，共筛选到66 个取耐渗入相关的基因，此中43 个基因差别表达。对差别表达基因及其调控通阐发可知，正在干燥和高渗前提下，克罗诺杆菌可以或许活跃生物膜的合成感化，发生更多的海藻糖不变胞内布局，堆集甜菜碱连结细胞水分，同时堆集钾离子、镁离子等电解质，从而添加细胞内渗入压以抵当干燥和高渗的感化。操纵MALDI-TOF MS对35 株克罗诺杆菌进行了精确的判定和聚类阐发。耐受试验成果表白，分手株对于37 ℃、6 天的干燥前提的失活率正在9。01%~77。57%，可耐受最高渗入压前提为6% NaCl，且生物膜构成能力取耐干燥能力呈正相关。通过组测序筛选出31 个取耐干燥相关的差别表达基因和43 个取耐渗入压相关的差别表达基因。克罗诺杆菌正在2 种处置前提下能够激活生物膜合成，发生更多海藻糖，堆集甜菜碱和电解质，不变胞内布局。同时，初次发觉cysM、thuF和ycjO等耐受相关基因。付世骞，女，宁波大学食物科学取工程学院，次要处置食物中无害微生物的检测、溯源取节制。近五年，以第一做者或通信做者颁发学术论文9 篇（此中中科院一区Top期刊论文5 篇），参取申请发现专利8 项。掌管象山县科技打算项目、东北农业大学乳品科学教育部沉点尝试室基金和宁波大学教研项目各1项，参取国度级、省级和横向课题10余项，获全国高校食物科学取工程专业尝试讲授案例三等。杨鑫焱，女，东北农业大学食物学院副传授，硕士研究生导师，次要处置乳品科学手艺取质量平安研究。近五年，以第一做者或通信做者颁发学术论文17篇，11篇为中科院一区Top期刊论文，3篇IF10；授权发现专利5项；掌管十四五国度沉点研发打算项目子课题，中国博士后面上赞帮，国度乳业手艺立异核心环节手艺攻关，省沉点研发打算等国度级和省级项目6项。姜毓君，男，东北农业大学食物学院二级传授、博士生导师，东北农业大学副校长、乳品科学教育部沉点尝试室从任。入选长江学者特聘传授、国度“万人打算”领甲士才。荣获全国食物平安工做先辈小我、中国食物科技学会科技立异——凸起贡献。担任国务院食物平安委员会专家委员会委员、中国养分保健食物协会副会长。次要处置乳成品、婴长儿配方食物和特医食物等特殊食物和功能食物研究，先后承担国度和省部级课题20余项。获得省科技前进二等2项，中国和美国专利22件，从编或配合出书专著教材8部。以第一做者或通信做者颁发学术论文200余篇，此中多篇论文被选为封面文章。牵头和参取多项国度食物质量平安律例、尺度和手艺规范的制定。